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mRNA差异显示方法研究进展

时间:2006-11-26栏目:临床医学论文

[关键词] DD-PCR 骨科学 研究

健康网讯:

马庆军 100083 北京医科大学第三医院骨科
党耕町 100083 北京医科大学第三医院骨科
宋国立 美国加州大学圣地亚哥分校骨科与生物工程系

   哺乳动物细胞约有100?000个不同的基因,在一定时间、空间中仅有10%~15%的基因表达,这种表达受到严格调控[1]。运用mRNA 差异显示(differential display,DD)方法[2],可将不同细胞类型或同一细胞在不同环境下表达的基因进行比较,从分子生物学水平上提供信息,这对理解细胞的生命过程极有帮助。该技术一经问世,立即得到广泛应用,但同时也遇到许多问题,所以Debouck[3]曾对该方法提出质疑。现将DD的研究进展简要综述如下。

  一、DD方法基本原理

  DD的基本原理是将具有可比性的细胞在某一条件下可表达的mRNA 群体通过逆转录方法变成相应的cDNA 群体,以此为模板,利用一对特殊引物,即3anchor 引物和5arbitrary引物,在一定条件下进行PCR扩增,得到与mRNA相对应的“标签”(tags),然后用变性聚丙烯酰胺测序胶分析其差别,将有差别的基因克隆化,进一步分析其结构与功能。DD依赖三种技术:(1)mRNA逆转录技术;(2)以特定引物进行的PCR技术;(3)DNA测序胶电泳技术。

  二、DD方法的优点及其应用

  用某一方法来寻找mRNA表达的差异,至少要满足下列要求:(1)在一定时间、空间里,每一个细胞约有15 000种mRNA表达,其中除少数属高丰度表达外,大量的属于低丰度表达,即要求使用的方法足以显示低丰度mRNA;(2)重复性要好;(3)实验过程中能够步步验证比较(side-by-side comparison);(4)得到的产物能代表相应的mRNAs或cDNAs,并能由此找到相应的cDNA 序列;(5)省时,简便易行。

   既往对mRNA的比较研究中多用减数杂交方法[4](subtraction hybridization),该方法灵敏,可显示低丰度RNA,但是步骤复杂,需时较长,而且在得到最终结果前无法步步验证对照比较,故不易重复,并且需要大量的RNA作起始研究材料。这一点对RNA来源不易者(如手术活检标本)极不利[5,6]

  DD的优点在于:(1)仅需0.2 μg总RNA作为起始材料;(2)可同时分析多组样品;(3)敏感性高,可检出低丰度mRNA;(4)实验周期短,约8天即可完成[7],便于重复;(5)最突出的优点是实验过程中可步步验证比较。可简单地将DD的特点概括为“3SRV”,即“Simplicity,Sensitivity,Speed,Reproducibility,Versatility”。

  DD方法因有上述优点,被广泛应用。例如:Musholt等[8]应用DD方法对手术切下的髓样甲状腺癌标本与局部转移的淋巴结进行了比较,发现了两个新的表达基因MDF-1和MDF-2,并认为这两个基因在髓样甲状腺癌的进展与转移中起了重要作用;Zuo等[9]研究溃疡性结肠炎的粘膜细胞,以正常结肠粘膜细胞作对照,找到了25个表达基因,其中有些与甲状旁腺瘤、T细胞受体-β、卵巢癌等表达的基因同源。

  关于神经再生问题,Livesey等[10]发现了Reg-2基因,并认为该基因是哺乳类动物运动神经元再生的关键基因。

  在骨科领域,也有许多用DD方法的研究,Ryoo等[11]找到了一个与成骨细胞表型发育有关的细胞增殖标志基因PROM-1(proliferating cell marker)。更令人鼓舞的是,Boden等[12]用一种新的骨形成蛋白LMP-1基因转染骨髓细胞,再作局部基因治疗,在动物实验中成功地进行了脊柱融合,LMP-1基因就是用DD方法克隆出来的。

  此外,DD还应用于心血管病[13]、糖尿病[14]、胚胎发育[15]、先天性疾病[16]以及药理学[17]和眼科学[18]等。不仅用于动物和人类,还应用于植物分子生物学研究[19]

  三、存在的问题与对策

  DD方法存在的问题概括起来有两方面:一是假阳性多(约50%~70%),二是得到的有差异cDNA片段短(约为110~500 bp)。因为这两个问题,使许多研究者踟蹰不前,这也是Debouk[3]提出质疑的原因之一。

  产生假阳性的原因,在于以下4个环节:(1)提取总RNA时,有染色体DNA污染,此DNA作为模板在PCR过程中被扩增;(2)从聚丙烯酰胺胶上挑选有差异条带时,实验组与对照组间信号对比不够显著;(3)在克隆阶段挑选阳性菌落时,未能排除基因克隆中的假阳性;(4)研究中多次使用PCR技术,很难避免实验室环境中的交叉污染。

  解决这一问题的对策是:(1)提取RNA操作严格,得到的RNA必须经过脱氧核糖核酸酶I(DNaseI) 充分消化,去除染色体DNA污染。(2)从聚丙烯酰胺胶上切取有差异条带时,首选实验与对照间信号差异显者,最好是互为有或无的关系;如果仅仅是强与弱的关系,放在次选位置上。(3)即使是差异显著地显现为一条带,也不能肯定是由某一cDNA 的均一分子泳动而成,有可能是结构不同而分子量相同的cDNA共泳动(Co-migrat)的结果。对此,可用mSSCP 方法区别开来[7]。也可在基因克隆挑选时,用Reverse Northern原理作菌落原位杂交进行筛选[20]。(4)关于交叉污染问题的克服应服从分子生物学一般原则。(5)有差异基因的最终确认是用Northern杂交,如果选取了十几或几十条差异条带,用Northern杂交工作量太大,若用Reverse Northern杂交则比较简便[20]

  DD扩增片段较短(≤500 bp),且扩增片段多位于3UTR(3untranslated region)范围内,很少能扩增到ORF (open reading frame)范围内。这一缺点是由使用的特殊引物所决定的,因此DD得到的是mRNA的标签(tags);由此带来另一个问题,即这一位于3UTR范围的标签与Gene Bank 数据库比较时,多数情况是与EST(expression seguence tags)比较,常不能满足研究者的要求。

  解决这一问题的对策是:(1)应用Targeted DD方法,基本原理是将5端引物延长,增加扩增片段的特异性[21,22];或者用Stone和Wharton[23]报道的“targeted RNA fingerprinting”方法。这样有可能使扩增片段特异性高,减少假阳性率,同时可能在Gene Bank数据库中得到更多结构与功能方面的信息;(2)用得到的cDNA 片段作probe

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