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实验动物塑料饮水瓶消毒条件的优化研究

时间:2006-11-26栏目:医药卫生论文

  实验动物塑料饮水瓶消毒条件的优化研究
  
  龙芝美 吴锦银 杨光宇 李文学 朱伟
  
  【摘要】  目的应用国家标准推荐的及实验室常用的高压灭菌方法对实验动物塑料饮水瓶进行消毒,观察三种不同消毒方式(温度、时间)消毒后塑料饮水瓶浸出液对L-929 细胞生长的影响。方法形态观察法和WST-1法。结果三种消毒方式消毒后,细胞培养基中均未见细菌生长。三种消毒方式下,细胞生长良好,细胞存活率和细胞增殖度均在50%以上。结论根据国家标准进行评价,三种高压灭菌方式对L929 细胞形态、生长和增殖有一定程度的影响,其中100℃ 60min的消毒方式较好,无细胞毒性作用,消毒后的产品具有良好的生物相容性,符合生物材料应用要求。
  
  【关键词】  SPF级实验动物设施;细胞毒性;WST-1法
  
  [Abstract]ObjectiveTo optimize the way of sterilize drinking water utensil used in animal experiment appliance.MethodsCell morphology observation assay and WST-1 assay were used.ResultsAs compared with the control,cell morphology and amount have been affected by the different sterilized ways.ConclusionAccording to the national criterion and the research results,the ways of 100℃ 60min is the better one.
  
  [Key words]SPF grade animal test appliance; Cytotoxicity; WST-1 assay
  
  为保证屏障级实验动物设施环境符合国家标准及保证实验动物和动物实验的质量,所有拟进入实验动物设施内部的物品必须经过一定的灭菌方法处理后才能带入实验设施内。饮水瓶是实验动物设施内动物饮水装备,其消毒灭菌措施一般为高压蒸汽灭菌,国家标准推荐的消毒灭菌温度为121℃维持20min.在实际工作中,发现动物饮水瓶尤其是新塑料饮水瓶在按照上述方式灭菌处理后会有塑料的臭味,虑及其盛装的水被直接饮用进入动物体内,因此要有良好的理化性能和良好的生物相容性。细胞毒性试验是利用体外细胞培养方法来评价生物材料、医疗器材或浸提液成分是否具有潜在的细胞毒性,以其简便、快捷、灵敏性高、节省动物等优点,被列为评价医用器材毒性的重要指标[ 1,2 ].本试验依据中华人民共和国国家标准《医疗生物学评价》(GB/T 16886-2003 ,idt ISO10993-5: 1992),分别采用三种常用的消毒灭菌温度对盛装动物饮用水的饮水瓶进行高温蒸汽灭菌,观察灭菌后瓶中的饮用水对小鼠成纤维细胞L-929生长抑制的影响,以评价这三种灭菌条件何者为优,为日常工作提供数据支持。
  
  1材料与方法
  
  1.1主要材料及试剂动物饮水瓶购于中国江苏枫叶实验动物笼具厂。L-929小鼠成纤维细胞株,购自中国科学院上海细胞库,用于实验的细胞传代次数为3——20.高糖DMEM培养基(粉剂)、新生牛血清均购自美国Gibco公司。WST-1细胞增殖试剂盒购自瑞士Roche公司。
  
  1.2实验方法取塑料动物饮水瓶3个,按照每平方厘米内表面积加入10ml动物饮用水的比例分别加入动物饮用水,并盖紧瓶塞。分别采用100℃ 60min、111℃ 40min和121℃ 20min三种灭菌方式处理后,自然冷却至室温备用。
  
  1.2.1细胞毒性试验按照DMEM培养基(干粉)说明书的配制比例,用不同方式灭菌处理后的动物饮用水溶解培养基来配制细胞培养液,调节pH值为7.4,用直径为0.22μm的滤膜过滤后,加入10%新生牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素,4 ℃储存备用。
  
  1.2.2细胞形态学观察将生长状态良好的L-929小鼠成纤维细胞按3×104/ml的密度接种于6孔板,随机分为4组,分别是对照组、1组(100℃ 60min组)、2组(111℃ 40min组)和3组(121℃ 20min组),每组3个平行样。细胞在37℃、5% CO2、95%湿度条件下培养24h后,弃去原培养基,溶剂对照组加入新鲜的DMEM培养基,其余各组则加入用相应动物饮用水配制的培养基,置细胞培养箱里继续培养。在细胞培养的第2、4、7天,用光学显微镜对每组细胞进行形态学观察并拍照。
  
  1.2.3测定细胞失贴壁率及细胞活性细胞分组及处理同上,在细胞培养的第2、4、7天,收集各组的培养基,同时用胰蛋白酶消化各组细胞,PBS清洗2次,加入适量新鲜培养基,用血球计数板在显微镜下进行细胞计数,分别计算失贴壁细胞数目及贴壁细胞数目,按下式计算细胞失贴壁率。细胞失贴壁率(%)=失贴壁细胞数目/(失贴壁细胞数目+贴壁细胞数目)×100%细胞按3×104/ml的密度接种于96孔培养板中,每孔体积100μl,细胞分组及处理同上。在细胞培养的第2、4、7天,用WST-1法分析细胞活性,用酶标仪在490 nm波长下测定吸光度(OD)值,按下式计算细胞相对增殖度(RGR)。RGR(%)=实验组组细胞OD(490)值/对照组细胞OD(490)值×100%按照RGR值将样品的毒性反应分级如下:0级为RGR≥100;1级为75——99;2级为50——74;3级为25——49;4级为1——24;5级为0.
  
  1.3统计学处理实验计量数据用均值±标准差表示,采用SPSS 11.0统计学软件,组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析法,组内差异比较采用Bonferroni法,α=0.05为检验水准。
  
  2结果
  
  2.1各组L-929细胞形态学变化光学显微镜下观察结果可见对照组细胞形态正常,贴壁生长良好,呈梭形或不规则的三角形。在用不同方式灭菌处理后的动物饮用水配制的培养液后第2天及以后,各组细胞贴壁生长仍较为良好,但可见少量的细胞圆缩,偶见悬浮死细胞。(图1)。
  
  2.2各组细胞失贴壁率的变化如表1所示,添加用不同方式灭菌处理后的动物饮用水配制的培养液后第2天,各实验组的细胞失贴壁率与对照组相比,差异无显著性(χ2=1.903,P>0.05)。在第4天,各实验组细胞失贴壁率均升高,与对照组相比差异有非常显著性(χ2=4.262,P<0.000)。在第7天,各实验组失贴壁率明显升高(χ2=42.502,P<0.000),其中组3细胞失贴壁率最高,为8.24%,是对照组细胞失贴壁率的10倍以上,差异具有非常显著性(P<0.01)。表1各组细胞失贴壁率
  
  2.3各组L-929细胞活性的变化如表2所示,在添加用不同方式灭菌处理后的动物饮用水配制的培养液第2天、第4天和第7天,实验组细胞活性明显低于对照组,差异均具有非常显著性(第2天,χ2=13.205,P<0.000; 第4天,χ2=17.731,P<0.000; 第7天,χ2=21.142,P<0.000)。表2各组细胞活性
  
  2.4各组L-929细胞增殖度的变化如表3所示,在添加用不同方式灭菌处理后的动物饮用水配制的培养液第2天、第4天和第7天,实验组细胞增殖度明显低于对照组,差异均具有非常显著性(第2天,χ2=27.172,P<0.000; 第4天,χ2=15.645,P<0.000; 第7天,χ2=11.087,P<0.000)。各组的细胞毒性分级为1级或2级。表3各组细胞增殖度
  
  3讨论
  

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