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肺结核病人疱疹病毒感染的检测和临床意义

时间：2023-02-20 08:40:28 基础医学论文我要投稿

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肺结核病人疱疹病毒感染的检测和临床意义

　　肺结核病人疱疹病毒感染的检测和临床意义
　　
　　作者：纪静许俊华徐翮飞罗兵
　　
　　【摘要】目的探讨肺结核病人疱疹病毒活动性感染情况。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA），检测62例肺结核病人和43例正常对照者血清中人巨细胞病毒（HCMV）和单纯疱疹病毒（HSV）特异性IgM抗体以及EB病毒（EBV）衣壳抗原（VCA）IgM抗体。同时，采用PCR?Southern检测肺结核病人和正常人外周血单个核细胞中EBV DNA表达。结果肺结核组血清HCMV?IgM和HSV?IgM阳性率分别为19.4%和12.9%,正常对照组分别为4.7% 和0,肺结核组HCMV?IgM和HSV?IgM阳性率均高于正常对照组（χ2=4.75、4.31,P<0.01）。肺结核组和正常对照组均未检测到EB病毒VCA?IgM,肺结核组EBV DNA阳性率（48.4%）高于正常对照组（4.7%），差异有显著性（χ2=22.92,P<0.01）。继发性肺结核疱疹病毒感染率（39.6%）高于原发性肺结核（7.1%），差异有显著性（χ2=3.84,P<0.05）。结论部分肺结核病人存在HCMV、HSV以及EBV的活动性感染，人疱疹病毒感染可能影响肺结核病情发生发展。
　　
　　【关键词】单纯疱疹病毒属；结核，肺；酶联免疫吸附测定
　　
　　[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the active infection of human herpesvirus in patients with tuberculosis （TB）。Me?thodsThe specific IgM antibodies against human cytomegalovirus （HCMV）， herpes simplex virus （HSV） and VCA of Epstein?Barr virus （EBV） in serum of 62 TB patients and 43 normal controls were detected by ELISA, and the expression of EBV DNA in mononuclear cells in peripheral blood of both groups by PCR?Southern.ResultsThe positive rates of anti?HCMV and anti?HSV IgM in the patients were 19.4% and 12.90%, respectively,and that in the control groups were 4.7% and 0. The positive HCMV?IgM and HSV?IgM in the patients were higher than that in the controls （χ2=4.75,4.31;P<0.01）。 However, VCA?IgM of EBV was not detected in both groups. The positive rate of EBV?DNA in the patients （48.4%） was significantly higher than that of the controls （4.7%,χ2=22.92,P<0.01）。 The infection of herpesvirus was higher in secondary TB （39.6%） than primary （7.1%）， the difference was significant （χ2=3.84,P<0.05）。ConclusionActive infection of HCMV,HSV and EBV exists in some TB patients,which suggests that human herpesvirus infection might impact the pathogenesis of TB.
　　
　　[KEY WORDS]Simplexvirus; Tuberculosis, pulmonary; Enzyme linked immunosorbent assay
　　
　　结核病的发病率近年来有增加趋势，严重危害人类健康，我国每年约有25万人死于各种结核病，位居各类传染病之首，结核病再次成为迫切需要解决的公共卫生问题。结核病病人尤其是重症病人常并发病毒感染，进而可引起难治性结核。人疱疹病毒在人群中具有较高的感染率，通常表现为潜伏感染，当机体抵抗力下降时可引起激活感染。本研究采集62例肺结核病人的血清，检测人巨细胞病毒（HCMV）?IgM、单纯疱疹病毒（HSV）?IgM和EB病毒衣壳抗原（VCA）?IgM抗体及外周血单个核细胞（PBMC）EBV DNA表达，了解肺结核病人疱疹病毒的感染状态，现报告如下。
　　
　　1 资料与方法
　　
　　1.1 一般资料
　　
　　本文62例肺结核病人为2006年7——12月在青岛市胸科医院呼吸科门诊就诊及住院病人，男36例，女26例；年龄15——85岁，平均50岁。诊断均符合世界卫生组织结核病会议修订的诊断标准[1].其中原发性肺结核14例，继发性肺结核48例。正常对照组43例，来自健康查体人群，年龄和性别与肺结核组相匹配。
　　
　　1.2 特异性IgM抗体的检测
　　
　　采集正常对照组和肺结核病人外周血，分离血清，采用ELISA法检测HCMV?IgM、HSV?IgM和VCA?IgM 抗体，ELISA检测试剂盒购自德国9VATEC公司。HSV抗体检测试剂盒不分型别，参照试剂盒说明书进行操作，对阳性和可疑阳性标本进行重复检验。
　　
　　1.3 EBV DNA的检测
　　
　　1.3.1 DNA样本制备
　　
　　采集正常对照组和肺结核病人的外周静脉血，EDTA抗凝，分离PBMC,酚?氯仿?异戊醇法常规提取细胞DNA,预冷无水乙醇沉淀核酸，自然干燥后用TE缓冲液（pH 8.0）溶解DNA,4 ℃ 保存备用。
　　
　　1.3.2 PCR?Southern
　　
　　参照文献[2]方法，选用EBV BamHⅠ?W 区特异性引物和探针，对提取细胞DNA 进行检测，上游引物序列为： 5′?CCAGACAGCAGCCAATTGTC?3′，下游引物序列为： 5′?GGTAGAAGACCCCCTCTTAC ?3′，探针序列为：5′?CCCTGGTATAAAGTGGTCCTGCAGCTATT?TCTGGTCGCATC?3′。PCR反应总体积为25 μL,反应体系为：10×Buffer 2.5 μL,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,上下游引物各0.5μmol/L, Taq DNA 聚合酶1.0 U,DNA 模板3 μL,同时设立阳性对照和阴性对照。阳性对照为EBV阳性的B95?8细胞，阴性对照为EBV阴性细胞系Ramos细胞。扩增条件为：94 ℃预变性5 min;然后94 ℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72 ℃ 45 s,扩增35个循环；最后72 ℃延伸5 min.取扩增产物10 μL 以20 g/ L 琼脂糖凝胶电泳后转印到尼龙膜上，与地高辛标记的寡核苷酸探针进行杂交反应，经碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体作用后，加酶的发光底物CSPD 作用5 min,自显影检测杂交信号。
　　
　　1.4 统计学处理
　　
　　采用四格表χ2检验进行统计学处理。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 特异性IgM抗体检测
　　
　　肺结核组HCMV?IgM阳性率高于正常对照组，差异有显著性（χ2=4.75,P<0.05）；HSV?IgM抗体阳性率也高于正常对照组，差异有显著性（校正χ2=4.31,P<0.05）；但肺结核组与正常对照组VCA?IgM 抗体均为阴性。见表1. 表1 肺结核组与正常对照组血清3种疱疹病毒特异性IgM抗体阳性率比较（略）
　　
　　2.2 不同型肺结核病人血清HCMV?IgM和HSV?IgM抗体检测
　　
　　原发性肺结核14例中HCMV?IgM 阳性1例，阳性率为7.1% ;继发性肺结核48例中HCMV?IgM 阳性11例，HSV?IgM阳性8例，阳性率为
　　
　　39.6%.继发性肺结核与原发性肺结核两种疱疹病毒抗体IgM检出阳性率比较差异有显著性（χ2=3.84,P<0.05）。
　　
　　2.3 EBV DNA检测
　　
　　肺结核组EBV DNA阳性率为48.4%（30/62），正常对照组EBV DNA阳性率为4.7%（2/43），肺结核组EBV DNA阳性率明显高于正常对照组，差异有显著性（χ2=22.92,P<0.01）。
　　
　　3 讨论
　　
　　疱疹病毒属DNA病毒，在我国人群中感染非常普遍，通常为潜伏感染，不引起临床症状，但在一定条件下可激活。与人类疾病有关的疱疹病毒有8 型，依次为单纯疱疹病毒1 型及2型（HSV?1、HSV?2）、水痘?带状疱疹病毒、Epstein?Barr病毒（EBV）、HCMV、人类疱疹病毒6型（HHV?6）、人类疱疹病毒7型（HHV?7）型和人类疱疹病毒8型（HHV?8）[3].目前世界范围内肺结核发病率呈升高趋势，肺结核病人尤其是重症肺结核病人若并发疱疹病毒感染，易造成诊断困难，病情复杂化以及疗效差等。本文对青岛地区肺结核病人疱疹病毒的感染情况进行了初步研究。
　　
　　血清特异性IgM抗体出现或效价升高被认为是病毒早期感染和潜伏病毒激活的标志之一。本文研究结果显示，肺结核病人血清HCMV?IgM和HSV?IgM抗体阳性率明显高于正常对照组，提示肺结核病人存在HCMV和 HSV的活动性感染。SKRIAGINA等[4]检测了44例急性发作期肺结核病人血清，结果证实肺结核病人存在HSV的机会性感染。很多文献已经证实，在机体免疫功能低下时常诱发疱疹病毒的活动性感染，肺结核病人多伴有细胞免疫功能紊乱，可导致潜伏感染状态的病毒激活，而活动性病毒感染又可促使结核菌活动，进而影响肺结核病人病情发生发展。免疫缺陷者分支杆菌感染概率明显增加，发生结核病的概率较正常人高得多。有文献报道，HCMV感染可引起短时间免疫缺陷，而免疫缺陷亦易引起HCMV感染[5]. SIRENKO等[6]对65例肺结核病人的研究显示，与病情稳定的肺结核病人比较，病情复杂的肺结核病人疱疹病毒IgM抗体检出率显著增高，提示巨细胞病毒感染可能影响肺结核的发生及病情进展。本文研究结果表明，继发性肺结核病人HCMV和 HSV活动性感染率明显高于原发性肺结核。
　　
　　VCA?IgM是EBV原发感染的标志，其在活动性感染中是否阳性目前尚无定论。有研究认为，VCA?IgM仅见于EBV的原发感染；个别研究发现激活感染时，VCA?IgM阳性。本研究同时检测VCA?IgM和EBV DNA,结果显示，肺结核组和正常对照组血清均未检测到VCA?IgM抗体，支持VCA?IgM仅见于EBV原发感染的观点；而肺结核病人EBV DNA的阳性率高于正常对照组，提示可能存在潜伏EBV的激活感染。因此，有必要对EBV DNA载量进行检测，以进一步明确结核病人EBV 的感染状况。
　　
　　疱疹病毒感染有潜伏感染和活动性感染两种形式，潜伏感染时病毒以相对非活性状态存在于细胞内，宿主细胞常常包含多个拷贝的病毒DNA,大部分保持游离形式，部分能与宿主细胞基因组整合，在某些因素作用下病毒可由潜伏状态转变为活动状态[7].肺结核系慢性消耗性疾病，可导致机体免疫功能降低，作为肺结核非病因性的人疱疹病毒潜伏感染可被激活，而疱疹病毒感染可能进一步导致免疫功能低下，从而影响病情进展。因此，对肺结核病人可检查疱疹病毒活动性感染指标，对伴有活动性感染者在用抗结核药物的同时使用抗疱疹病毒类药物，可缓解病人病情，有利于病人康复。
　　
　　【参考文献】
　　
　　[1]MAHER D, CHAULET P, SPINACI S, et al. Treatment of tuberculosis: guidelines for national programs[M]. 2nd ed. Geneva, Switzerland: World Health Organization, 1997:231?273.
　　
　　[2]梁华，罗兵，王云，等。胃癌和相应癌旁组织中EB病毒感染的检测[J]. 青岛大学医学院学报， 2003,39（4）：428?432.
　　
　　[3]钟江。疱疹病毒科学研究进展[J]. 国外医学：微生物学分册， 2003,26（4）：41?48.
　　
　　[4]SKRIAGINA E M, KOLOMIETS A G, GRITS M A, et al. Tuberculosis and opportunistic infection[J]. Probl Tuberk, 1999（6）：25?26.
　　
　　[5]DE LA HOZ RE, STEPHENS G, SHERLOCK C. Diagnosis and treatment approaches of CMV infection in adult patients[J]. J Clin Virol, 2002,25（Suppl 2）：S1?S12.
　　
　　[6]SIRENKO IA, SHMAT'KO S A, SMELIANSKAIA M V, et al. Impact of cytomegalovirus infection on the course of tuberculosis in children and adolescents[J]. Probl Tuberk Bolezn Legk, 2003（8）：7?9.
　　
　　[7]何妙侠。 EB病毒与T细胞淋巴瘤[J]. 诊断病理学杂志， 1998,5（1）：43?46.

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