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血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及发病机制

时间:2006-11-26栏目:基础医学论文

  血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及发病机制
  
  作者:姜彩肖 张丽梅 杭景仙
  
  【摘要】  目的 研究血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆障碍及发病机制。方法 4血管阻断法制作模型,Morris水迷宫法检测学习记忆能力,免疫组化法观察Bcl2和Bax表达,流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率,亚甲蓝比色法检测血清中H2S含量。结果 模型组大鼠学习记忆能力明显减退。Bcl2/Bax在缺血再灌注(I/R)开始时升高,随后开始下降。模型组大鼠海马神经细胞凋亡率明显增加。模型组大鼠血清中H2S含量明显减少。血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率间呈明显负相关。 结论 VD可导致学习记忆障碍,海马神经细胞凋亡和血清中H2S含量减少;海马神经细胞凋亡程度可能与内源性H2S生成减少有关。
  
  【关键词】  血管性痴呆;学习记忆;免疫组化;流式细胞术;硫化氢
  
  血管性痴呆(VD)是老年期痴呆的主要类型之一,它是由一系列脑血管因素(缺血、出血、急慢性缺氧性脑血管病等)导致脑组织损害引起的以认知功能障碍为特征的痴呆综合征〔1〕,不仅给病人带来长期痛苦,严重影响其生活质量,而且给家庭、社会造成沉重负担,因此研究VD的发病机制以指导其防治具有很高的社会价值和现实意义。H2S是第三类气体信号分子,广泛参与机体的多种生理和病理过程,为进一步了解其在VD发病中的作用,本研究观察大脑缺血/再灌注(I/R)不同时间对大鼠学习记忆能力的影响、血清中H2S含量改变及海马CA1区神经细胞凋亡情况,从行为学、细胞凋亡及内源性H2S表达量及其相互关系等方面,探讨VD的发病机制,为其防治提供理论依据。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 动物与分组 健康Wistar雄性大鼠64只,体重300——350 g(由河北省实验动物中心提供),随机分为8组,正常组,假手术组和VD模型组,VD模型组又分为大脑I/R 2,8,24,72,168和720 h组,每组8只动物。
  
  1.2 动物模型制备 4血管阻断法(4VO法)〔2〕建立VD大鼠模型。假手术组医学专用及手术过程与VD模型组相同,但不电凝双侧椎动脉,不阻断双侧颈总动脉。术后按再灌注的不同时间分别将动物处死,经主动脉依次灌注生理盐水100 ml和4%多聚甲醛500 ml,取出脑组织,石蜡包埋切片,用于免疫组化显示Bcl2、Bax及苏木素伊红(HE)染色。
  
  1.3 学习记忆能力的测定 Morris水迷宫检测〔3〕:实验开始于VD术后4 w,预先将迷宫任意分为4个象限。平台放入上述4个象限中随机选择的1个象限中,在大鼠游泳池边标记4点作为大鼠的入水点,记录120 s内大鼠从入水到爬上平台所需的时间,即逃避潜伏期。记录各组大鼠的逃避潜伏期,作为学习记忆能力检测指标。
  
  1.4 取材 大鼠10%水合氯醛(3 ml/kg体重)腹腔注射医学专用后,快速开胸暴露心脏,心尖取血4——5 ml,分离血清,用于血清H2S含量测定;然后断头处死,并立即在冰台上开颅,迅速分离大鼠海马,用70%酒精固定,4℃冰箱保存过夜,用于流式细胞术检测。
  
  1.5 HE染色 切片常规脱蜡至水→1%盐酸酒精分化→伊红染色2 min→切片常规梯度酒精脱水→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→中性树胶封固。
  
  1.6 免疫组化染色(SP法) Bax兔抗鼠多克隆抗体,Bcl2兔抗鼠多克隆抗体(Santa Cruz公司生产)。
  
  1.7 流式细胞术检测 采用美国Beckman Coulter公司生产的EpicsXL Ⅱ型流式细胞仪。
  
  1.8 血清中H2S含量的检测 亚甲蓝分光光度法。
  
  1.9 统计学处理 用SPSS13.0统计软件,采用单因素方差分析,两两比较采用SNK法。
  
  2 结 果
  
  2.1 学习记忆能力检测结果 各组大鼠在迷宫各入水点搜索平台的结果见表1,随着训练天数的增加,各组大鼠的逃避潜伏期均缩短,第2天I/R 720 h组与正常组和假手术组比较逃避潜伏期明显延长(P<0.01);正常组和假手术组逃避潜伏期差异不显著(P>0.05)。
  
  2.2 VD大鼠病理形态学结果 HE染色后,神经细胞胞浆呈淡红色,核呈蓝黑色。假手术组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、密集,细胞完整,结构正常,胞浆丰富,胶质细胞无增生;细胞核呈圆形、椭圆形,无变性,无固缩或溶解现象。VD模型组海马CA1区神经元排列紊乱,神经元变性,体积变小,胞核与胞浆界限不清,核固缩成三角形或不规则形,而且随I/R时间的延长,变性神经元数目越多,见图1. 表1 各组逃避潜伏期比较
  
  2.3 凋亡蛋白表达结果
  
  2.3.1 VD大鼠模型海马CA1区Bcl2表达 VD模型组I/R 2 h Bcl2蛋白平均OD值开始明显上调,I/R 8 h达到高峰,之后随I/R时间的延长开始下降,但I/R 24 h组仍高于假手术组。假手术组与I/R不同时间点组间,Bcl2的表达情况均有显著差异(P<0.01)(表2)。
  
  2.3.2 VD大鼠模型海马CA1区Bax的表达 I/R早期Bax在海马CA1区的表达明显增强,随着再灌注时间的延长,其表达量不断增加,I/R 72——168 h达高峰。假手术组与I/R不同时间点组之间,Bax的表达均有显著差异(P<0.01)(表2)。
  
  2.3.3 Bcl2/Bax比率变化 随I/R时间的延长,Bcl2/Bax的比率逐渐降低(表2)。表2 VD大鼠Bcl2、Bax的表达水平与假手术组比较:1)P<0.05,2)P<0.01
  
  2.4 流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率结果 随着I/R时间的延长,大鼠海马神经细胞凋亡率逐渐增高,其中I/R 2 h组凋亡率最低,I/R 168 h组凋亡率最高。VD模型各时间组与假手术组比较,海马神经细胞凋亡率明显增加(P<0.01);I/R不同时间组间两两比较,各组间海马神经细胞凋亡率均差异显著(P<0.01),见表3.
  
  2.5 血清H2S含量检测结果 随着I/R时间的延长,大鼠血清H2S含量呈现直线降低趋势,其中IR 2 h组血清H2S含量最高,I/R 168 h组血清H2S含量最低。VD模型各时间组与正常组和假手术组比较,血清H2S含量明显减少(P<0.01);I/R不同时间组间两两比较,血清H2S含量均差异显著(P<0.01);正常组和假手术组血清H2S含量无显著差异(P>0.05),见表3.
  
  2.6 血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率相关分析 随着血清H2S含量的降低,海马神经细胞凋亡率逐渐升高,两者呈现明显的负相关,回归方程为:y=-0.135x+12.068,相关系数r=-0.861(P<0.01),提示内源性H2S可能具有保护神经细胞的功能。表3 各组海马神经细胞凋亡率及血清H2S含量(各组间两两比较:1)P<0.01
  
  3 讨 论
  
  目前认为,I/R后神经元死亡的机制是损伤级联反应,脑缺血性损伤级联反应大多以能量衰竭和兴奋性氨基酸毒性开始,以细胞凋亡结束。本实验中用HE染色观察到海马CA1区大量细胞呈现明显的凋亡特征,VD模型组大鼠海马CA1区可见神经元排列紊乱,神经元变性,体积变小,核固缩成三角形或不规则形,胞核与胞浆界限不清。流式细胞术检测海马神经细胞的凋亡率发现VD模型各组与假手术组相比海马神经细胞凋亡率明显增加,而且随着I/R时间的延长,大鼠海马神经细胞的凋亡率逐渐增加。
  
  在参与调控神经元凋亡的基因和蛋白质产物中,一类

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