微生物常规鉴定技术

时间: 2008-07-08 栏目: 特种医学论文

微生物常规鉴定技术
一、形态结构和培养特性观察

1、微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落(colony)。不同微生物在某种培养基中生长繁殖,所形成的菌落特征有很大差异,而同一种的细菌在一定条件下,培养特征却有一定稳定性。,以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。

  1)细菌的培养特征包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况

  2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。

二、生理生化试验

  微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物,生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。

  微生物检验中常用的生化反应有:

1、糖酵解试验

  不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异,或能利用或不能利用,能利用者,或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。

  试验方法:以无菌操作,用接种针或环移取纯培养物少许,接种于发酵液体培养基管,若为半固体培养基,则用接种针作穿刺接种。接种后,置36±1.0°C培养,每天观察结果,检视培养基颜色有无改变(产酸),小倒管中有无气泡,微小气泡亦为产气阳性,若为半固体培养基,则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡,有时还可看出接种菌有无动力,若有动力、培养物可呈弥散生长。

  本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力,从而进行各种细菌的鉴别,因而每次试验,常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫,溴百里蓝和An-drade指示剂。

2、淀粉水解试验

  某些细菌可以产生分解淀粉的酶,把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再变蓝色。

  试验方法:以18~24h的纯培养物,涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板(一个平板可分区接种,试验数种培养物)或直接移种于淀粉肉汤中,于36±1°C培养24~48h,或于20°培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面,若为液体培养物,则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果,阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。

  淀粉水解系逐步进行的过程,因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间,培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性,以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱,因而以临用时制备为妥。

3、V-P试验

  某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称V-P(+)反应。

  试验方法:

  1)O’Meara氏法:将试验菌接种于通用培养基,于36±1°C培养48h,培养液1ml加O’Meara试剂(加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液)1ml,摇动试管1~2min,静置于室温或36±1°C恒温箱,若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有主张在48~50°C水浴放置2h后判定结果者。

  2)Barritt氏法:将试验菌接种于通用培养基,于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入5°Cα萘酚(2-na-phthol)纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml,摇动2~5min,阳性菌常立即呈现红色,若无红色出现,静置于室温或36±1°C恒温箱,如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。

  3)快速法:将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环,乳化接种于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氢氧化钠水溶液2滴,振动后放置5min,判定结果。不产酸的培养物不能使用。

  本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时,通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生,故应省去或以氯化钠代替。

4、甲基红(Methyl Red)试验

  肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸,进一步分解中,由于糖代谢的途径不同,可产生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,可使培养基PH值下降至pH4.5以下,使甲基红指示剂变红。

  试验方法:挑取新的待试纯培养物少许,接种于通用培养基,培养于36±1°C或30°C(以30°C较好)3~5天,从第二天起,每日取培养液1ml,加甲基红指示剂1~2滴,阳性呈鲜红色,弱阳性呈淡红色,阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。

  甲基红为酸性指示剂,pH范围为4.4~6.0,其pK值为5.0。故在pH5.0以下,随酸度而增强黄色,在pH5.0以上,则随碱度而增强黄色,在pH5.0或上下接近时,可能变色不够明显,此时应延长培养时间,重复试验。

5、靛基质(Imdole)试验

  某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合,形成玫瑰吲哚,为红色化合物。

  试验方法:将待试纯培养物小量接种于试验培养基管,于36±1C培养24h时后,取约2ml培养液,加入Kovacs氏试剂2~3滴,轻摇试管,呈红色为阳性,或先加少量乙醚或二甲苯,摇动试管以提取和浓缩靛基质,待其浮于培养液表面后,再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴,在接触面呈红色,即为阳性。

  实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应,若先用二甲苯或乙醚等进行提取,再加试剂,则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色,因而结果更为可靠。

6、硝酸盐(Nitrate)还原试验

  有些细菌具有还原硝酸盐的能力,可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。

  试验方法:临试前将试剂的A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面,立即或于10min内呈现红色即为试验阳性,若无红色出现则为阴性。

  用α-萘胺进行试验时,阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。

7、明胶(Gelatin)液化试验

  有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶),能将明胶先水解为多肽,又进一步水解为氨基酸,失去凝胶性质而液化。

  试验方法:挑取18~24h待试菌培养物,以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天观察结果,若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化,如确被液化,即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂,若为阳性,10~20min后,菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。

8、尿素酶(Urease)试验

  有些细菌能产生尿素酶,将尿素分解、产生2个分子的氨,使培养基变为碱性,酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶,因为不论底物尿素是否存在,细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。

  试验方法:挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中,摇均,于36±1℃培养10,60和120min,分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面,不要到达底部,留底部作变色对照。培养2,4和24h分别观察结果,如阴性应继续培养至4天,作最终判定,变为粉红色为阳性。

9、氧化酶(Oxidase)试验

  氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶,氧化酶先使细胞色素C氧化,然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化,产生颜色反应。

  试验方法:在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴,阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色,Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。

10、硫化氢(H2S)试验

  有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物,而产生硫化氢气体,硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。

  试验方法:在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中,沿管壁穿刺接种,于36±1℃培养24~28h,培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法:将待试菌接种于一般营养肉汤,再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空,以不会被溅湿为适度;用管塞压住置36±1℃培养1~6天。纸条变黑为阳性。

11、三糖铁(TSI)琼脂试验

  试验方法:以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物,穿刺接种并涂布于斜面,置36±1℃培养18~24h,观察结果。

  本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气(变黄);产生硫化氢(变黑)。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄,但因量少,生成的少量酸,因接触空气而氧化,加之细菌利用培养基中含氮物质,生成碱性产物,故使斜面后来又变红,底部由于是在厌氧状态下,酸类不被氧化,所以仍保持黄色。

12、硫化氢-靛基质-动力(SIM)琼脂试验

  试验方法:以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度,置36±1℃培养18~24h,观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性,混浊或沿穿刺线向外生长为有动力,然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面,静置10min,若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部,可作为对照。

  本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选,与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。

三、血清学试验

  血清学反应是指:相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用,可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中,常用血清学反应来鉴定分离到的细菌,以最终确认检测结果。

  血清学反应的一般特点:

  1)抗原体的结合具有特异性,当有共同抗原体存在时,会出现交叉反应。

  2)抗原体的结合是分子表面的结合,这种结合虽相当稳定,但是可逆的。

  3)抗原体的结合是按一定比例进行的,只有比例适当时,才能出现可见反应。

  4)血清学反应大体分为两个阶段进行,但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段,反应速度很快,只需几秒至几分钟反应即可完毕,但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段,表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢,需几分、几十分以至更长时间。而且,在第二阶段反应中,电解质、PH、温度等环境因素的变化,都直接影响血清学反应的结果。

  习惯上将经典的血清学反应分三种类别:凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。

1、凝集反应

  颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合,在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象,称为凝集反应(Agglutination reaction)。其中的抗原称为凝集原,抗体称为凝集素。在该反应中,因为单位体积抗体量大,做定量实验时,应稀释抗体。

  1)直接凝集反应

  颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应,称为直接凝集反应(Direct agglution reaction)。

  a.玻片凝集法。是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴,在玻片上混匀,数分种后若出现肉眼可见的凝集块,即阳性反应,证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便,但不能进行定量测定。

  b.试管凝集法。是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集试验。因为要测定抗体的含量,故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度,然后加入等量抗原,37℃或56℃,2~4小时观察,血清最高稀释度仍有明显凝集现象的,为该抗血清的凝集效价。

  2)间接凝集反应

  将可溶性抗原(抗体)先吸附在一种与免疫无关的,颗粒状微球表面,然后与相应抗体(抗原)作用,在有电解质存在的条件下,即可发生凝集,称为间接凝集反应(Indirect agglutination)。由于载体增大了可溶性抗原的反应面积。当载体上有少量抗原与抗体结合。就出现肉眼可见的反应,敏感性很高。

2、沉淀反应

  可溶性抗原与相应抗体结合,在有适量电解质存在下,经过一定时间,形成肉眼可见的沉淀物,称为沉淀反应(Precipitation)。反应中的抗原称为沉淀原,抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大,为了不使抗原过剩,故应稀释抗原,并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。

  1)环状沉淀反应:是一种定性试验方法,可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中,然后沿管壁徐徐加入等量抗原,如抗原与抗体对应,则在两液界面出现白色的沉淀圆环。

  2)絮状沉淀反应:将已知抗原与抗体在试管(如凹玻片)内混匀,如抗原抗体对应,而又二者比例适当时,会出现肉眼可见的絮状沉淀,此为阳性反应。

  3)琼脂扩散试验:利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散,若抗原抗体对应,且二者比例合适,在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体,就可分别形成几条沉淀线。琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型。单向扩散是一种定量试验。可用于免疫蛋白含量的测定。而双向扩散多用于定性试验。由于方法简便易行,常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分。

3、补体结合反应

  补体结合反应(Complement fixation reaction)是在补体参与下,以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性,能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合,就会出现溶血现象,如果与细菌及相应抗体复合物结合,就会出现溶菌现象。因此,整个试验需要有补体、待检系统(已知抗体或抗原、未知抗原或抗体)及指示系统(绵羊细胞和溶血素)五种成份参加。其试验原理是补体不单独和抗原或抗体结合。如果出现溶菌,是补体与待检系统结合的结果,说明抗原抗体是相对应的,如果出现溶血,说明抗原抗体不相对应。此反应操作复杂,敏感性高,特异性强,能测出少量抗原和抗体,所以应用范围较广。