分析方法的验证

分析方法的验证

分析方法的验证，就是对药品分析实验所采用的分析方法是否完全达到了预期目的，或证明由分析方法误差而导致试验结果判断错误的概率是否在允许范围之内，而进行的科学证明。
　　分析方法的验证以验证参数表示。在制定药品质量标准时，可通过这些参数证明所建立的分析方法是否适当。本文所述分析方法验证是指下述情况：药局方新收载品种质量标准的建立；药局方已收载品种质量标准的修订；根据药局方的通则建立替代方法。

1　日本药局方收载分析方法所需资料

1.1　概要　对分析方法作简要说明，包括所采用分析方法的必要性，特点与优点及有关验证的要点。如系分析方法的修订，则需阐明新方法与原方法的区别以及新方法的优势。
1.2　分析方法　本项记载的有关分析方法的内容要足以能对分析方法进行评价，并且必要时可用复核试验进行评价。分析方法主要记载内容包括：分析的步骤、标准品及样品的制备方法、试剂与试药的调配、注意事项、分析系统是否正常运转的检验证明方法(例如高效液相色谱法中的分离效率的研究)、分析结果的计算公式、测定次数等。并且，如果使用了药局方以外的装置，还需详述有关内容；如果使用了新的标准品，则必须提供其物理、化学及生物学特征数据，并提供其质量标准。
1.3　有关分析方法验证的资料　本项应包括求导各验证参数的试验设计、试验数据、计算结果及检定结果等。

2　验证参数(validationcharacterisitics)

　　分析方法适当与否可通过验证参数进行评价，下面列举了最典型的分析方法验证参数的定义及其评价方法。
　　验证参数的有关术语及定义因分析方法的应用领域不同而不同，本文所使用的术语及定义仅限于日本药局方。评价方法项下所述内容也仅为简要概述。确定验证参数的方法很多，采用何种方法没有具体限制。但是，验证参数的限值常因确定方法的不同而发生变化。故此，确定验证参数的实验方法、实验数据、计算方法等应尽可能详细地记述。
　　本文分析方法验证中未包括验证参数适应性/牢固性(Robustness)的讨论，这是由于牢固性的研究主要在分析方法的开发设计阶段进行，其研究结果可以在方法的分析条件或注意事项中得到体现。
2.1　真度/准确度(Accuracy/Trueness)
2.1.1　定义：所谓准确度，指分析方法所得测定值的偏离程度，通常以测定值的总平均值与真值之间的差来表示。
2.1.2　评价方法：准确度一般以测定室内重现精度或室间再现精度时所得总平均值与真值的差表示。真值一般使用理论值(如滴定法)，如果理论值不存在或即使存在但很难求出的情况下，可采用经过确证或认可的数值来代替(如制剂分析常以原料药的测定值作为真值)。分析方法的专属性强，可以推断其分析方法的误差就小。由推出的真值与室内(室间)再现精度的标准偏差即可计算出真值的95%置信区间，并可判断这个区间是否包括0点，或区间的上下限值是否在分析方法所要求的精度范围之内。
2.2　精密度(Precision)
2.2.1　定义：精密度是指从均匀样品中抽取的复数个供试品进行重复分析测定时，所得到的一系列测定数据彼此之间的一致程度。测定值的误差以偏差、标准偏差、或相对标准偏差的形式表示。精度根据重复实验的条件不同以三个水平表示，分别称为：并行精度、室内再现精度、室间再现精度。
　　并行精度(Repeatability/Intra-assayprecision)：指实验室、实验者、实验日期、装置、器具以及试药的批号等实验条件均未改变的情况下，从均匀样品中抽取的复数个供试品短时间内进行重复分析测定时(并行条件)的精度。
　　室内再现精度(Intermediateprecision)：指同一实验室内，实验者、实验日期、装置、器具以及试药的批号等实验条件一部分或全部改变的情况下，从均匀样品中抽取的复数个供试品进行重复分析测定时(室内再现条件)的精度。
　　室间再现精度(Reproducibility)：指在不同实验室间，从均匀样品中抽取的多个供试品进行重复分析测定时(室间再现条件)的精度。
2.2.2　评价方法：首先，要保证精度研究所用样品的数量和均匀性。溶液应为均匀性样品，在得不到均匀性样品时，通常将大量制剂粉碎混合至认为均匀或制剂的各组分混合至认为均匀的样品作为均匀性样品使用。如果同时做两个水平以上的精度评价时，可以采用诸如单因素方差分析等实验方法，但为了正确得出分析方法的精度，必须有足够的实验次数、分析条件的水平数及实验室数。并且要对可预想到的致使分析发生变化的要因进行研究。各水平的精度以偏差、标准偏差、相对标准偏差、偏差的90%置信区间以及与其相对应的标准偏差的区间来表示。将其与分析方法所要求精度的标准值进行对照，以确定分析方法是否可行。通常是以室内(间)的再现精度作为方法取舍的依据。
2.3　专属性/特异性(Specificity)
2.3.1　定义：专属性指分析样品中有共存物质的情况下，对被测物质进行正确测定的能力，即表示分析方法的识别能力。如果分析方法的专属性有个别缺陷，可以用其他方法加以补充。
2.3.2　评价方法：确证分析方法是否达到试验目的，确实能够对被测物质进行鉴别或定量。例如，分析方法的专属性可以通过比较A为仅含被测物质样品(阳性对照)；B为含有制剂的其他各组成成分及不纯物或分解产物中添加被测物质的样品；C为不含被测物质，仅含制剂的其他组分、不纯物及分解产物的样品(阴性对照)，根据A、B、C三种样品的分析结果进行评价。如果不纯物不易得到时，可以用含有不纯物的样品(如经时发生变化的样品)替代。
2.4　检出限界(Detection Limit)
2.4.1　定义：检出限界是指样品中所含的被测物质可被检出的最低量或浓度。在检出限界内并不意味着一定就能够进行定量。
2.4.2　评价方法：通常以消费者危险率及生产者危险率在5%以下来规定检出限界。检出限界可以通过空白样品或检出限界附近的样品测定值的标准偏差以及检出限界附近的标准曲线的斜率算出。例如，根据检出限界附近的标准曲线的斜率以及空白样品测定值的标准偏差，由下式求出检出限界。
　　DL=3.3σ/slope
　　DL：检出限界
　　σ：空白样品测定值的标准偏差
　　slope：检出限界附近标准曲线的斜率
　　应用色谱法时，测定值的标准偏差可以用信噪比代替。分析方法的检出限界应比质量标准中规定值要小。
2.5　定量限界(Quantitation Limit)
2.5.1　定义：定量限界是指样品中所含的被测物质可被进行定量的最小量或最低浓度。定量限界所述样品测定值的精度，以相对标准偏差表示，一般为10%。
2.5.2　评价方法：通常定量限界可以通过空白样品或被测物定量限界附近的样品测定值的标准偏差以及定量限界附近的标准曲线的斜率算出。例如，根据定量限界附近的标准曲线的斜率以及空白样品测定值的标准偏差，由下式求出定量限界。
　　DL=10σ/slope
　　DL：定量限界
　　σ：空白样品测定值的标准偏差
　　slope：定量限界附近标准曲线的斜率
　　应用色谱法时，测定值的标准偏差可以用信噪比代替。分析方法的定量限界应比质量标准中规定值要小。
2.6　线性关系
2.6.1　定义：线性关系是指分析方法能够得到与被测物质的量或浓度具有直线关系的测定值的能力，必要时，被测物质的量或浓度的测定值也可以是从数学公式中得到的变换值。
2.6.2　评价方法：准备一系列不同浓度(量)的被测样品，按照分析方法的操作步骤进行测定，用测定值得到的回归方程及相关系数对线性关系进行评价。必要时，将测定值由回归方程算出的残差对被测物质的量(浓度)作图，不应具有某种特定的趋势。通常，采用5个不同量(浓度)的样品作线性关系的研究。
2.7　范围(Range)
2.7.1　定义：分析方法验证中所述范围是指具有一定精度和准确度的被测物质上限及下限量(浓度)之间的领域。对于上述具有线性关系的分析方法则指：具有一定精度和准确度，并且使线性关系成立的被测物质上下限量(浓度)之间的领域。
2.7.2　评价方法：分析方法验证的范围一般为标准中规定值的±20%左右，对范围的上下限值及范围中央值附近的样品进行精度、真度及线性的研究讨论。

3　试验分析方法的分类

　　根据试验目的，试验方法主要可以分为以下3种类型，各类型分析试验方法的验证所要求的验证参数见表1。应该指出，这仅是一个原则，评价分析方法所必需的验证参数将随分析方法的特点及试验目的而改变。

表1　试验类型与所要求的验证参数

验证参数 类型Ⅰ 类型Ⅱ 类型Ⅲ 定量试验 限度试验 准确度 - + - + 精密度 并行精度 - + - + 室内再现精度 - -* - -* 室间再现精度 - +* - +* 专属性 + + + + 检出限界 - - + - 定量限界 - + - - 直线性 - + - + 范围 - + - + 　　注：-：一般不需要；+：需要；*：视情况而定。室内或室间再现精度选择其一进行评价，日本药局方通常选择后者进行评价。

　　类型Ⅰ需做鉴别试验，即对药品中的主要成分及其特征进行鉴别。类型Ⅱ需做检查试验，即对药品中的杂质或不纯物的量进行测定。类型Ⅲ需做含量测定和溶出度试验，即对药品中的成分进行测定(成分包括稳定剂、添加剂等)和药品有效性试验。

4　分析方法验证用语

4.1　适应性/牢固性(Robustness)　指故意将分析条件在小范围内变化时，测定值不受影响的能力。例如，反应的pH值、温度、室间及试药的量等分析条件在适当的范围内改变时，对测定值的稳定性进行研究讨论。测定值对于分析条件不稳定时，应对方法加以改进。适应性的研究结果在分析方法中以表示分析条件的有效数字或注意事项的形式得以体现。
4.2　实验室　指试验进行的场所、设施。分析方法验证中所述改变实验室是指试验者、装置以及试药的批号等试验条件发生变化。
4.3　试验法　指药局方中的试验方法，例如鉴别试验、检查试验等。试验方法应包括样品的制备、规定值、分析方法等。
4.4　生产者危险率　指合格的制品由于试验原因而错判为不合格制品的发生概率。一般以α表示，也叫第一过失率，也就是在限度试验中所说的假阳性率。
4.5　消费者危险率　指不合格的制品由于试验原因而错判为合格制品的发生概率。一般以β表示，也叫第二过失率，也就是在限度试验中所说的假阴性率。
4.6　测定次数　指分析方法操作程序中规定的次数，为了提高分析方法的精度，有些试验明确规定试验次数在2次以上，分析方法验证是对包括分析方法所规定的测定次数在内的分析方法的评价。它与为了提高分析方法的精度进行重复分析时的重复次数不同。
4.7　测定值　一次分析所得到的一个数值。

本文译自第13版日本药局方附录参考资料3所载内容。

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