鹅膏菌多肽毒素在生命科学研究中的应用

鹅膏菌多肽毒素在生命科学研究中的应用

　　鹅膏菌多肽毒素在生命科学研究中的应用
　　
　　张志光　张晓元　李东屏
　　
　　摘要　鹅膏菌多肽毒素是野生毒磨菇产生的主要毒素，常引起人和动物的中毒与死亡。由于鹅膏毒肽对真核细胞的RNA聚合酶Ⅱ具有专一性抑制作用以及鬼笔毒肽对肌动蛋白具有束缚作用，它们在生命科学研究中具有重要的应用价值，并对生命科学的发展产生了很大的促进作用。本文拟综述鹅膏毒肽和鬼笔毒肽在生命科学中应用的研究进展。
　　
　　关键词　鹅膏菌属　鹅膏毒肽　鬼笔毒肽　生命科学
　　
　　中图分类号　R996.2　Q949.98
　　
　　Application of amanita toxic peptides in life sciences research
　　
　　Zhang Zhiguang, Zhang Xiaoyuan, Li Dongping
　　
　　Biology Institute of Hunan Normal University,Changsha 410081,China
　　
　　Amanita toxic peptides are the main toxins in wild mushrooms and often result in animal and human intoxication and death.Due to the specific inhibition to eukaryotic cell RNA polymerases Ⅱ by amatoxins and the binding to actin by phallotoxins,amanita toxic peptides play important roles in life science researches.This paper presents a latest review of applications of amanita toxic peptides in life scientific researches.
　　
　　Key words:amanita, amatoxins, phallotoxins, life science
　　
　　人误食有毒的鹅膏菌（Amanita）后，产生腹泻、腹痛、呕吐、幻觉、昏迷等多种症状，致死率相当高。在19世纪60年代后，就已对鹅膏菌的毒性成份进行研究，到本世纪80年代已分离纯化鉴定的鹅膏菌毒素包括鹅膏毒肽（amatoxins）、鬼笔毒肽（phallotoxins）、毒伞素（virotoxins）、毒蝇碱（muscarine）、异恶唑（isoxazole）衍生物、鹅膏氨酸（ibotenic acid）以及muscimol、coprine等[1,2].鹅膏毒肽是一类双环八肽，天然的鹅膏毒肽包括α-鹅膏毒肽（α-amanitin,又译为“鹅膏菌碱”）。β-鹅膏毒肽（β-amanitin）、r-鹅膏毒肽、ε-鹅膏毒肽、三羟鹅膏毒肽（amanin）、三羟鹅膏毒肽酰胺（amaninamide）、二羟鹅膏毒肽酰胺（amanullin）、二羟鹅膏毒肽羧酸（amanullinic acid）、和二羟鹅膏毒肽酰胺原（proamanullin）九种。鬼笔毒肽是一类双环七肽、天然的鬼笔毒肽包括二羟鬼笔毒肽（phalloidin）、一羟鬼笔毒肽（phalloin）、三羟鬼笔毒肽（phallisin）、一羟鬼笔毒肽原（prophalloin）、羧基一羟鬼笔毒肽（phallisacin）、羧基二羟鬼笔毒肽（phallacidin）、羟基三羟鬼笔毒肽（phallsacin）七种。毒伞素是一类单环七肽，其天然毒性成分有6种。在鹅膏菌毒素中，引致人和动物死亡的主要为amatoxins,LD50（小白鼠）一般为0.2——0.5mg/kg,从人中毒事件分析，人的LD50则更低[3].amatoxins属于慢作用毒素，一般中毒后5——12天死亡，死亡率高达90%,而phallotoxins为快作用毒素。动物腹腔毒性试验，在2——4h引致死亡，LD50为1.5——4.0mg/kg[4].virotoxins的毒性及机理和phallotoxin相似。
　　
　　在鹅膏菌多肽毒素的研究过程中，由于发现了α-amanitin对真核生物RNA聚合酶Ⅱ的专一性抑制作用和phalloidin对肌动蛋白的专一性束缚作用，从而推动了分子生物学、细胞生物学、发育生物学、医学生物学等学科的发展。反过来，由于这些学科的实验研究中对amanitin和phalloidin及其衍生物的应用也不断地促进和丰富了对鹅膏菌多肽毒素的研究和应用。鹅膏菌多肽毒素的化学结构、性质、毒理等已由Wieland和Faulstich进行了综述与评论[1,5].本文拟对鹅膏菌多肽毒素（主要为amatoxins和phallotoxins）在生命科学研究中的应用进行综述。
　　
　　1　真核细胞mRNA合成的专一性抑制剂
　　
　　自α-amanitin被分离纯化后，其毒性机理经过十多年的研究，直到Fiume等人观察到amanitin中毒的小白鼠肝细胞的核仁碎裂，并且发现细胞核中RNA含量持续减少[6],鹅膏毒肽作用的分子机理才得以逐步揭示出来。体外或体内由amanitin处理的鼠肝细胞核的RNA合成被严重阻断，认为amanitin抑制RNA聚合酶的活性[7].Seifart和Sekeris（1969）发现10 ng/ml的α-amanitin抑制了体外的依赖于DNA的RAN聚合酶活性[8].由于Roeder和Rutter（1969）成功地从海胆胚胎中分离出三种RNA聚合酶，并且从鼠肝中分离出两种RNA聚合酶（Ⅰ和Ⅱ，以后又分离第Ⅲ种）[9],随即，确定了α-amanitin（低至5——10 ng/ml的浓度）是抑制了海胆、鼠肝和小牛胸腺的RNA聚合酶Ⅱ的活性，而对RNA聚合酶Ⅰ不起作用[10,11],并且也发现RNA聚合酶Ⅲ对α-amanitin也敏感，但其被抑制的浓度为RNA聚合酶Ⅱ的103——104倍高浓度[12].Vaisius 和Wieland进一步揭示出[13],amatoxins对RNA聚合酶Ⅱ的抑制是非竞争性抑制型，它们是阻止RNA聚合酶Ⅱ在一磷酸二酯键形成后与新生RNA沿DNA模板的移位，它们和RNA聚合酶Ⅱ、DNA模板与新生的RNA形成稳定的四元复合物，因为在α-鹅膏毒肽存在时，RNA聚合酶仍能合成二核苷酸。
　　
　　amanitin对线粒体内的RAN聚合酶（浓度高达40[13]）、叶绿体内的聚合酶（浓度高达100[13]）以及原核生物的RNA聚合酶没有抑制作用[14,15].不同真核生物的RNA聚合酶Ⅱ对α-amanitin的敏感程度有很大的差异，一般是进化越高级的生物则其被抑制的程度越高。哺乳动物的细胞、以及鱼和昆虫的RNA聚合酶Ⅱ对α-amnaitin高度敏感，其抑制常数（Ki）为3×10-9——5×10-8M[16——19],植物的RNA聚合酶Ⅱ的Ki较动物的高些[20,21].而一般的真菌的RNA聚合酶Ⅱ的Ki较植物高10到几百倍[22——24].在鹅膏菌属中，含与不含amantoxins的种间的RNA聚合酶Ⅱ对α-amanitin的Ki是有悬殊差异的[25],Johoson等报道含有amatoxins的A.hygroscopica和A.suballiacea的子实体的RNA聚合酶Ⅱ的Ki分别为2.0×10-3M和3.3×10-3M,而不聚积amatoxins的A.brunnescens和A.alliacea的Ki分别为1.0×10-5M和9.8×10-6M[26],这说明自身含有amatoxins的鹅膏菌对amatoxins有很高的抗性。这些研究表明在应用amntoxins抑制真核生物的mRNA生物合成时，要根据不同的物种的具体情况而定。
　　
　　2　基因的组织结构和细胞定位
　　
　　低浓度的amatoxins抑制真核生物RNA聚合酶Ⅱ的活性，高浓度的amatoxins一般能抑制RNA聚合酶Ⅲ的活性，而对RNA聚合酶Ⅰ无作用。amatoxins的这一特性使之成为一类非常有用的生物试剂，它们与RNA聚合酶Ⅰ的专一性抑制剂放线菌素D[27,28]、RNA聚合酶Ⅲ的专一性抑制剂tagetitoxin以及蛋白质合成的抑制剂放线菌酮等一起研究真核细胞基因的结构组织、功能与表达及调控。
　　
　　应用RNA聚合酶对α-amanitin的敏感性差异可以确定基因的转录是由哪一类RNA聚合酶控制。Kundel等发现hnmRNA的后熟依赖snRNA U6,该snRNA为RNA聚合酶Ⅰ合成，而其它几种snRNA为RNA聚合酶Ⅲ合成[29].通过离体转录发现人的L1逆转录转座子启动子的转录被Tagetitoxin抑制而不被α-amanitin抑制，这不同于果蝇的L1启动子转录受α-amanitin所抑制，从而表明人L1逆转录转座子启动子是RNA聚合酶Ⅲ依赖性的[30].在Leishmania donovani中发现2.2Mb染色体上两个LD1基因在同源重组时被复制到1.2Mb染色体上的rRNA基因座上，被RNA聚合酶Ⅰ所转录，表现为抗α-amanitin,而在2.2Mb染色体上的两个基因被RNA聚合酶Ⅱ转录而被α-amanitin抑制，结果导致这两个基因的转录丰度和表达的基因产物都比正常的要高[31].
　　
　　借助抗α-amanitin的突变的特性除研究转录中酶的动力学特性和分子机理外，还可观察细胞融合的杂合子的基因表达。Zuckerman等将鸡红细胞与抗α-amanitin的鼠原粒细胞（myeloblast）融合，在抑制鸡RNA的聚合酶Ⅱ的α-amanitin存在时，而鸡的专一性蛋白仍被合成[32].
　　
　　amatoxins对于基因的细胞定位研究也有重要意义。Padetzky等（1987）发现藻类的RuBP羧化酶的小亚基是核内基因编码，可被α-amanitin所抑制，而大亚基的基因在叶绿体中，其表达被原核生物的转录和翻译的抑制剂所抑制[33].
　　
　　3　基因的表达和调控
　　
　　在细胞分裂和分化发育过程中，α-amanitin被当作抑制剂用于分析和研究不同的RNA聚合酶的发生顺序和功能。这些研究在动物发育方面尤为突出，如小鼠卵细胞和胚胎、兔受精卵、瓜蟾和海胆的卵等[34——39].Sevigny利用amatoxin的抑制转录特性，研究小白鼠受精卵的发育，发现胞质伴侣蛋白TRiC的一个亚基TRiC-P5在胚胎中表达是在二细胞时期，是受精卵基因组激活合成的首个蛋白产物[40].Marakhova等研究发现人淋巴细胞快速转化中Na,K-ATP酶阳离子泵的长期增强首先受翻译然后受转录的控制，他们用植物凝集素激活人淋巴细胞从间期转换到分裂期时观察到在起始阶段（5——20h）、阳离子泵的正调节可被放线菌酮所抑制，而α-amanitin和放线菌素D不起作用，第二阶段（20h后）则相反，其调节被α-amanitin抑制，而放线菌酮不起作用[41].
　　
　　4　肿瘤和病毒的研究
　　
　　amatoxins对于肿瘤治疗具有诱人的潜在开发价值。Grna报告了用α-amanitin治愈氨基偶氮甲苯（aminoazotoluene）诱发的小鼠皮肤肿瘤的成果。他反复向肿瘤注射极稀的α-amanitin,初次注射产生局部炎症，以后的注射使肿瘤坏死，紧接着损伤部位很快愈合[42].Bermbach等将β-amanitin与表皮生长因子结合，由于肿瘤细胞A431含有的表皮生长因子的受体含量比正常细胞高100倍以上，在一定浓度时，β-amanitin与表皮生长因子的复合体主要进入A431细胞，从而抑制A431细胞的生长[43].因此，根据肿瘤细胞和正常细胞的差异，利用amatoxins的特性控制和治疗肿瘤是治疗癌症的一个很有前景的途径。
　　
　　在病毒的研究方面，amatoxins一直是获取病毒在细胞中复制信息的工具。如果病毒的复制被amatoxin抑制，则显示该病毒的繁殖依赖于寄主细胞的转录结构。一般在细胞核内复制的DAN病毒对amatoxins是敏感的，如疱疹病毒、腺病毒12猿病毒、禽支气管炎病毒和小麦多斑花叶病毒[44——46].在细胞质中复制的DNA病毒，利用病毒自身的聚合酶，对amatoxins不敏感。对于RNA病毒，一般不受amatoxins的抑制。但也有一些RNA病毒的复制被α-amanitin抑制，它们依赖了宿主细胞的RNA聚合酶，如粘液病毒[47,48].类病毒PSTV和CEV的复制也受amantoxins的抑制[49].
　　
　　5　细胞结构与功能
　　
　　微丝是构成细胞骨架的重要成分，其主链蛋白由丝状肌动蛋白（F-actin）构成，F-actin是由球状肌动蛋白（G-actin）聚合组装而成。在正常生理状态下，F-actin与G-actin之间的聚合和解聚是一个动态的平衡过程，这一动态过程的进行就关系到ATP水解释放能量与细胞质运动、细胞内运输和肌肉运动等生理过程。phallotoxins专一性地与F-actin结合，从而极大地稳定F-actin的结构。virotoxins也具有与phallotoxins对F-actin相同的作用机制。phallotoxins和virotoxins促使了（尤其是最适度以下的条件）G-actin的聚合，并且稳定了F-actin的丝状结构。phalloidin与viroidin和F-actin的解离常数（KD）很小，phalloidin的KD为3.7×10-8M,3H-demethyl-phalloidin的KD为3.6×10-8M.在相当的程度内，在基质稀释后，phalloidin并不影响G-actin的结合速率，而是完全阻止了新生的F-actin在两端的解离。
　　
　　phallotoxins用荧光物质标记后，可做为F-actin的探针，在研究细胞骨架结构和功能中有广泛地应用。phallotoxins可被连接多种荧光标记，而发生不同的荧光，主要包括：荧光素（fluorescein,FL）发生黄绿色荧光、四甲基若丹明（tetramethyrhodamine,RH），产生红色荧光[50].荧光标记的FL-和RH-phallotoxins分别只呈现出phalloidin对F-actin的10%和20%亲和力，因而它们的毒性减小，但它们仍能紧密地和专一地束缚F-actin.应用荧光标记的phallotoxin,可以研究细胞中F-actin的存在、分布与定位以及actin结构与细胞运输等[51,52].
　　
　　荧光标记的phallotoxins对于肌肉结构的研究具有重要意义[53].Zhukarey等对骨骼肌和心肌以rhodamine-phalloidin染色后的染色分布的研究结果支持了伴肌动蛋白能阻碍phalloidin对骨骼肌原纤维束缚和nebulett能阻碍phalloidin对心肌细肌丝束缚的假说。amatoxins在细胞核的形态、结构和功能的研究中也有重作用。
　　
　　*国家科委重点课题93-（7）-03
　　
　　作者简介：张志光，男，大学，教授
　　
　　作者单位：张志光　张晓元　李东屏（湖南师范大学生物所，长沙　410081）
　　
　　参考文献
　　
　　1　Wieland Th.Peptides of poisonous Amanwta Mushrooms.New York: springer-Verlag Inc,1986

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